在細胞生物學研究中，
24孔板0.4µm細胞培養小室無菌是構建細胞共培養體系、研究細胞遷移與侵襲能力的經典工具。該孔徑既能有效分隔上下室細胞，允許信號分子自由流通，又能阻止細胞隨意穿越，是模擬體內生理屏障的理想模型。然而，這一精密實驗的成功與否，高度依賴于嚴格的無菌操作流程。本文將系統闡述從實驗準備到細胞接種的全過程無菌操作規范，旨在為科研工作者提供一套標準化、可復制的操作指南。
一、實驗準備與環境滅菌：構筑無菌防線
在進行任何細胞操作之前，構建一個潔凈的無菌環境是首要前提。這不僅關乎實驗結果的準確性，更直接決定了細胞能否存活。
1.超凈工作臺預處理：實驗開始前，需提前打開超凈工作臺的紫外燈，照射臺面及內部物品30分鐘以上，以殺滅空氣中的微生物。照射結束后，關閉紫外燈，開啟風機運行10-15分鐘，排出殘留的臭氧。操作前，需用75%酒精棉球擦拭臺面及雙手。
2.耗材與試劑消毒：將預熱的培養基、PBS緩沖液、胰蛋白酶等試劑瓶外表面用75%酒精擦拭后放入超凈臺。所有接觸細胞的耗材，如移液器吸頭、離心管等，必須確保無菌。操作過程中應始終在酒精燈火焰旁的無菌區域內進行，打開的瓶口需短暫過火滅菌。
二、小室預處理與膜潤濕：打通物質交換通道
0.4µm的微孔膜是實驗的核心，其預處理直接關系到后續細胞能否正常貼壁生長及信號分子的通透性。
1.膜潤濕操作：將Transwell小室小心放入24孔板的對應孔位中。使用無菌移液器，向上室（小室內）緩慢加入100-200µL的無血清培養基或PBS緩沖液。加入液體時，槍頭應盡量貼近小室壁，避免液體直接沖擊膜面產生氣泡。這一步驟的目的是利用液體浸潤膜孔，排出膜內的空氣，確保膜全部水化。若膜上殘留氣泡，會阻礙營養物質通過，導致局部細胞死亡。
2.氣泡排除技巧：加入液體后，仔細觀察膜表面。若發現氣泡附著，可輕輕傾斜小室，或用槍頭在膜邊緣輕輕引導，使氣泡匯集后排出。確認膜面濕潤均勻且無氣泡后，將小室置于37℃培養箱中平衡至少30分鐘，或直接進行下一步操作。
三、細胞懸液制備與無菌接種：精準投放生命種子
細胞接種是無菌操作中最關鍵的環節，任何疏忽都可能導致微生物污染，前功盡棄。
1.細胞消化與重懸：取對數生長期的細胞，棄去舊培養基，用PBS清洗后加入適量胰蛋白酶進行消化。待細胞變圓脫落時，加入含血清的培養基終止消化，輕輕吹打制成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至無菌離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
2.細胞計數與稀釋：用適量的無血清培養基（用于遷移實驗）或培養基重懸細胞沉淀。使用細胞計數板或自動計數儀進行計數，并根據實驗需求調整細胞密度至適宜濃度（通常為1×10^5至5×10^5 cells/mL）。
3.無菌接種：用無菌移液器吸取適量細胞懸液（通常為100-200µL），緩慢加入Transwell小室的上室中。加入時動作要輕柔，避免產生氣泡或液體濺出。接種完成后，可輕輕晃動培養板，使細胞均勻分布在膜上。
4.下室培養基添加：向24孔板的下室（即小室下方的孔內）加入500-600µL的培養基（或含特定趨化因子的培養基）。添加時需注意，下室液面高度應略低于小室內的液面，或與之持平，切勿過高導致液體滲入上室，破壞濃度梯度。
四、培養觀察與終點處理：守護數據完整性
細胞接種完成后，需將培養板放入37℃、5%CO2的培養箱中進行培養。培養期間，應盡量避免頻繁取出觀察，以減少溫度波動和污染風險。通常培養12-48小時后，可根據實驗設計進行固定、染色和細胞計數。
總結
24孔板0.4µm細胞培養小室無菌操作流程，本質上是一場與微生物污染的博弈。從環境滅菌到膜潤濕，再到細胞接種，每一個步驟都要求操作者具備高度的無菌意識和嫻熟的技巧。只有嚴格遵守上述流程，才能確保實驗數據的真實可靠，為生命科學研究提供堅實的數據支撐。
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更新時間：2026-02-10 
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